Лабораторная работа № 3

Методы количественного определения активности ферментов

Работа 1. Количественное определение активности каталазы крови

(по Баху и Зубковой)

Цель – определить активность каталазы крови (по Баху и Зубковой)

Фермент каталаза (оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6) содержится в большом количестве в эритроцитах и разлагает перекись водорода с образованием кислорода и воды по уравнению:

2Н2О2 → каталаза О2 + 2Н2О

При количественном определении активности каталазы крови измеряют или количество перекиси водорода, разложенной каталазой, или количество кислорода, выделившегося при этой реакции. Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы.

Каталазным числом называют количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл крови согласно следующей реакции:

2КМnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4→2KHSO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5O2

О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества КМпО4, израсходованного на титрование до и после действия каталазы.

Показателем каталазы называют дробь, в которой числителем является каталазное число, а знаменателем - число миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

При количественном определении активности каталазы нужно сравнивать показатели каталазы, а не каталазные числа, так как фермент содержится почти исключительно в эритроцитах и притом не в гемоглобине, а в строме. Содержание каталазы в крови снижается при ряде заболеваний, таких, как рак, анемия , туберкулез и др.

Ход работы . 1. Приготовление раствора крови . В мерную колбу на 100 мл наливают около 10 мл дистиллированной воды. 0,1 мл крови вносят в колбу с водой. Пипетку промывают несколько раз, набирая жидкость и выпуская её в мерную колбу. Доливают мерную колбу до метки водой, следовательно, кровь развели в 1000 раз и получили основной раствор крови, в 1 мл которого содержится 1 мкл крови. В этом растворе определяют каталазное число.

2. Приготовление опытных и контрольных проб . В две конические колбы на 25 мл (опытную и контрольную) наливают по 7 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 мл основного раствора крови. Контрольную колбочку кипятят в течение 2 мин для разрушения каталазы, а опытную оставляют без изменения. После этого обе колбочки оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем в каждую колбочку вносят точно 2 мл 1% раствора Н2О2 и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

3. Титрование и расчет . В каждую колбочку приливают по 5 мл 10% раствора Н2SO4 и оттитровывают содержимое колбочки 0,1 н. раствором КМпО4 до розового окрашивания.

Рассчитывают активность каталазы, исходя из того, что на титрование контрольной колбочки, где каталаза разрушена, пойдет больше раствора КМпО4, чем на титрование опытной колбочки. Полученную разность умножают на 1,7 и получают каталазное число для исследуемой крови.

Пример расчета . Грамм-эквивалент Н2О2 равен 17 г. Следовательно, в 1 мл 0,1 н. раствора содержится 11,7 мг Н2О2. 1 мл 0,1 н. КМпО4 эквивалентен 1 мл 0,1 н. Н2О2; умножая 1,7 на разность между количеством миллилитров 0,1 н. КМпО4, пошедшего на титрование в контрольной и в опытной колбочках, получают количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл исследуемой крови, т. е. получают сразу каталазное число. В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц.

Исходя из того, что в 1 мкл крови содержится около 5 млн. эритроцитов, можно рассчитать показатель каталазы:

Вывод

Работа 2. Определение активности каталазы сырого молока

Цель – определить активность каталазы сырого молока; на основании полученных данных отнести исследуемый объект к нормальному или анормальному молоку.

В основу метода положено определение количества разложенного ферментом пероксида водорода. Каталаза - двухкомпонентный фермент, димер, гемопротеид (в активном центре имеет протогематин). Молекулярная масса фермента 225000...230000, оптимум действия находится при рН 7,0...8,0 и температуре 20...40°С (рJ – при рН 5,4...5,7). Действие каталазы проявляется уже при 0°С, нагревание до 75...80°С разрушает её.

Возможный механизм действия каталазы описывается уравнениями:

Каталаза-FеОН + Н2О2 → Каталаза-FеООН + Н2О

Каталаза-FеООН + Н2О2 → Каталаза-FеОН + О2 + Н2О

Активность каталазы выражают в стандартных (Е) и международных (нкат) единицах, а также через объём кислорода, выделившегося из определенного объема молока при определенных условиях.

Зависимость между отдельными единицами активности каталазы: 1 Е = 16,67 нкат = 6,25 см3 кислорода.

Нативная каталаза переходит в молоко из клеток молочной железы, содержится в альбуминовой фракции. Бактериальная каталаза накапливается в молоке при развитии микроорганизмов. Молочнокислая микрофлора каталазу не вырабатывает. Этой способностью обладают психротрофные и гнилостные бактерии. Поэтому определение активности каталазы можно использовать для контроля количества последних в молоке (она может составлять выше16,0 Е).

Повышенная активность каталазы в анормальном молоке позволяет также выявлять его примесь в сборном молоке.

Активность каталазы в свежевыдоенном молоке, полученном от здоровых животных, составляет 4,0 - 16,0 Е, в молозиве 50 - 94, в стародойном молоке – 37 - 50, в маститном - 62 Е и более.

Для определения активности каталазы используют полярографический, манометрический и перманганатометрический методы. Последний метод наиболее точен.

Сущность метода состоит в количественном определении пероксида водорода, разложенного каталазой, содержащейся в 1 см3 молока, за 1 мин при 25°С.

Неразложившийся пероксид водорода оттитровывают раствором перманганата калия в кислой среде (см. реакцию выше).

Количество разложившегося пероксида водорода находят по разнице между контрольным и опытным титрованием.

Ход работы . Перед началом работы часть исследуемого молока кипятят для разрушения каталазы.

В две конические колбы вместимостью 200 см3 пипетками вносят в первую - 2 см3 сырого молока (опытная проба), во вторую - 2 см3 кипяченого молока (контрольная проба). Температура молока (20 ± 1)°С. В обе колбы цилиндром добавляют по 98 см3 дистиллированной воды с температурой (20 ± 1)°С, содержимое колб перемешивают, колбы нагревают на водяной бане до температуры (25 ± 1)°С. Затем в обе колбы пипеткой добавляют по 25 см3 0,3%-ного раствора пероксида водорода, колбы закрывают пробками, их содержимое тщательно перемешивают; колбы помещают в термостат при температуре (25 ± 1)°С. Записывают время начала опыта.

Через 30 мин в обе колбы из бюретки вносят по 5 см3 10%-ного раствора серной кислоты и титруют из бюретки раствором перманганата калия (Сэ = 0,1 моль/дм3) до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Исчезновение окрашивания в более поздний срок связано с окислением органических составных частей молока.

Обработка результатов . Активность каталазы в стандартных единицах рассчитывают по формуле:

где Vk - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование контрольной пробы, см3;

Vo - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование опытной пробы, см3;

1,7 - масса пероксида водорода, соответствующего 1 см3 раствора перманганата калия с эквивалентной концентрацией 0,1 моль/дм3, мг;

m - объем молока, см3 (m = 2 см3);

t - продолжительность выдержки молока с раствором пероксида водорода, мин (t = 30 мин);

0,034 - масса 1 мкМ пероксида водорода, мг.

После подстановки известных значений формула принимает вид:

АЕ = (Vk - Vo ) · 0,83 (Е)

Примечание. 1 . Предлагаемая методика измерения активности каталазы рекомендуется для исследования сырого молока с активностью каталазы не выше 20 Е. 2. При исследовании анормального молока следует брать для анализа не все разведение молока (100 см3), а 20 см3. В этом случае расчетная формула будет иметь вид:

АЕ = (Vk - Vo ) · 4,15 (Е)

Вывод

Работа 3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц

Цель – определить сукцинатдегидрогеназу мышц.

Сукцинатдегидрогеназа (КФ 1.3.99.1) очень распространена в тканях животных, растений и микроорганизмов, катализирует дегидрирование янтарной кислоты, при котором последняя превращается в фумаровую кислоту:

При добавлении в среду окисленной формы метиленовой синей, восстановленная сукцинатдегидрогеназа передает водород на метиленовую синюю, образуя бесцветное лейкосоединение:

Материалы исследования и реактивы:	Оборудование:
1. Гомогенат мышц (в 1 мл 100 мг ткани)	1. Пробирки химические
	2. Автоматические пипетки
а) 9,078 г однозамещенного кислого фосфорнокислого калия растворяют в 1 л прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды	3. Стеклянные палочки
4. Термостат
5. Ледяная баня
б) 11,867 г двузамещенного кислого фосфонокислого натрия (Na2HPO4·12H2O) растворяют в 1 л прокипяченной дистиллированной воды в) смешать полученные растворы в соотношении 1:1
3. Янтарная кислота, 0,01 н. нейтрализованный раствор
4. Метиленовая синяя, 0,05% раствор
5. Агар-агар

Ход работы . В две пробирки (опытную и контрольную) помещают 2 мл гомогената мышц. Содержимое контрольной пробы кипятят и охлаждают.

В обе пробирки наливают по 1 мл фосфатного буфера рН 6,8, по 2 мл 0,01 н. нейтрализованного раствора янтарной кислоты и по 2 капли 0,05% раствора метиленовой синей.

Заливают содержимое обеих пробирок 2 мл подогретого агар-агара и кладут их на лёд для застывания. Пробирки помещают в термостат при 37°С. Опыт считают законченным, когда в опытной пробирке жидкость будет почти бесцветной. В контрольной пробирке жидкость не изменяет окраску, поскольку фермент денатурируется при нагревании.

Критерием активности сукцинатдегидрогеназы является время обесцвечивания метиленовой синей в присутствии янтарной кислоты в анаэробных условиях.

Работа 4. Определение эффективности пастеризации молока пробой на

лактопероксидазу

Цель – определить активность лактопероксидазы, на основании полученных результатов отнести исследуемый объект к пастеризованному, либо непастеризованному молоку.

Способность пероксидазы выдерживать нагревание до 80°С положена в основу метода контроля высокотемпературной пастеризации молока (ГОСТ 3623-73. «Молоко и молочные продукты. Методы определения пастеризации»).

Фермент пероксидаза относится к классу оксидоредуктаз, катализирует окисление различных соединений в присутствии пероксида водорода вследствие выделения активного атомарного кислорода.

Пероксидаза - двухкомпонентный фермент, димер, гликогемопротеид, его молекулярная масса составляет 76000 - 93000, имеет оптимум действия при рН = 6,0 - 7,0 и температуре 20 - 25°С (рJ фермента = 9,6). Фермент термоустойчив, инактивируется при температуре выше 80°С. Возможна его реактивация после нагревания. Механизм действия фермента описывается уравнением:

Н2О2 → О + Н2О

Нативная пероксидаза (лактопероксидаза) синтезируется клетками молочной железы; часть её поступает в молоко с лейкоцитами (миелопероксидаза). Фермент связан с альбуминовой фракцией молока.

В молоке содержится 3 - 10 мг% пероксидазы, в молозиве её содержание выше. Активность пероксидазы в свежевыдоенном молоке также довольно высока и составляет 370 нкат.

Лактопероксидаза вместе с тиоцианатом и пероксидом водорода входит в антибактериальную систему молока. Так, лактопероксидаза катализирует окисление тиоцианата, а образующиеся продукты (гипотиоцианат и др.) подавляют жизнедеятельность микроорганизмов, особенно грамотрицательных, в том числе патогенных.

Как указывалось выше, пероксидаза расщепляет пероксид водорода с образованием активного атомарного кислорода. Активный кислород окисляет йодид калия, при этом восстанавливается йод.

При наличии крахмала в реакционной смеси она принимает сине-фиолетовое окрашивание.

Ход работы. В пробирку вместимостью 10 см3 пипеткой вносят 5 см3 исследуемого молока, 5 капель раствора йодкалиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ного раствора пероксида водорода. Содержимое пробирки перемешивают после добавления каждого реактива. Через 2 мин анализируют окрашивание содержимого пробирки.

Оценка результатов . Если окрашивание молока в пробирке не изменилось, то фермент, пероксидаза в нем отсутствовал, следовательно, молоко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 80°С.

Появление в пробирке сине-фиолетового окрашивания свидетельствует о наличии пероксидазы. Следовательно, молоко не подвергалось пастеризации или температура пастеризации была ниже 80°С, или пастеризованное молоко было смешано с непастеризованным.

Появление окрашивания в пробирках более чем через 2 мин после добавления реактивов, не указывает на отсутствие пастеризации, так как может быть вызвано разложением реактивов.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5% непастеризованного молока к пастеризованному.

Вывод

Вопросы

1. Какие вещества называются ферментами?

2. Каковы их химическая природа и свойства?

3. Что такое специфичность действия ферментов и как она определяется?

4. Как зависит активность ферментов от температуры?

5. Как влияет величина рН среды на ферментативную активность?

6. Какие вещества называются активаторами и ингибиторами ферментов? Приведите примеры

7. Какие качественные и количественные методы используются для изучения действия ферментов?

8. Что представляет собой единица активности ферментов?

9. На чем основан метод определения активности амилазы и каково диагностическое значение этого определения?

10. Как определяют активность каталазы крови?

11. Каковы основные принципы метода определения активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах?

Введение

Настоящее пособие предназначено для ознакомления студентов как с классическими методами исследования ферментов, так и с современными, высокочувствительными аналитическими методами, использующими ферменты как инструменты исследований. Пособие состоит из пяти разделов:

1. Методы определения активности ферментов.

2. Изучение кинетических параметров ферментативных реакций.

3. Методы выделения и очистки ферментов.

4. Изучение субклеточной локализации ферментов.

5. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов.

Все разделы «Практикума» имеют самостоятельные задачи, однако требования, предъявляемые к студентам, остаются одинаковыми. Каждая предлагаемая работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении любой из них студент должен самостоятельно подготовить все нужные растворы, освоить необходимые методы исследования, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками.

Уровень используемых методических приемов соответствует требованиям современной науки. При необходимости в описании работы приводятся краткие теоретические сведения. Все работы, включенные в «Практикум», неоднократно выполнялись студентами.

Работа 1. Титрометрическое определение активности каталазы

Оборудование и реактивы: кипящая водяная баня; пипетки на 5, 10, 20 и 25 мл; цилиндры измерительные с носиком на 10 и 25 мл; колба мерная на 100 мл; колбы конические на 200 мл; ступка с пестиком фарфоровые; перманганат калия (0,1 н); серная кислота (10 %); карбонат натрия; пероксид водорода (0,1 н); свежий растительный материал (картофель или морковь).

2 г сырого картофеля (или моркови) растирают в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат натрия до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до объема 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30 минут, после чего ее фильтруют. Далее определяют активность по схеме (2 опытных пробы и 2 контрольных):

Опыт и контроль титруют 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин бледно-розового окрашивания). Отмечают количество раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося (после ферментативного разложения) пероксида водорода в опытной колбе и на титрование всего пероксида водорода в контрольной. По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.

Расчет ведут в соответствии с уравнением реакции:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 > 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,

согласно которому 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.

Пример расчета: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной 30,2 мл 0,1 н раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2 - 15,5) 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7 1,7) 24,99 мг. Значит, в 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное разложить = 99, 96 мг пероксида водорода, а за 1 мин - (99,96:30) 3,33 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (3,33:0,034) 100 Е каталазы.

1. Рассчитайте содержание каталазы в исследуемом материале.

2. Напишите систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.

Каталаза – очень распространенный дыхательный фермент, присутствующий практически в любом биологическом материале растений и животных.

В процессе дыхания в качестве побочного продукта окисления веществ образуется перекись водорода, оказывающая в высоких концентрациях токсичное действие на цитоплазму. Обезвреживание перекиси происходит при участии фермента каталазы (одна из его функций), разлагающей ее на воду и молекулярный кислород по уравнению:

каталаза

2 Н2О2 2Н2О +О2

Об активности каталазы судят по объему кислорода, выделяющегося в результате разложения перекиси водорода.

Для определения пользуются прибором, который состоит из каталазника, бюретки емкостью 50 мл и стеклянной груши, соединенных каучуковыми трубками и стеклянным тройником, каучуковая трубка на конце тройника снабжена винтовым замком. Бюретка и стеклянная груша закреплены на штативе. Их заполняют дистиллированной водой до половины объема.

ХОД РАБОТЫ

0,5 г листьев растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком и добавляют 0,5 г мела для создания щелочной реакции (рН=7,7 оптимальная для данного фермента).

Во время растирания вливают небольшими порциями 20 мл воды, смесь вносят в одно колено каталазника. В другое колено помещают 5 мл 3%-ной перекиси водорода. Каталазник соединяют с каучуковой трубкой, не допуская смешивания жидкостей.

Открывают зажим и перемещением воронки устанавливают уровень воды в бюретке на нуле. Закрывают зажим и быстрым изменением положения каталазника смешивают жидкость в обоих коленах. Затем все время потряхивая каталазник по снижению уровня воды в бюретке отмечают объем кислорода в мл, выделенного в течении 3 минут на 1 г массы сырого материала.

Во время опыта каталазник нельзя держать всей ладонью, так как при нагревании от руки воздух в колбе расширяется, что может повлиять на точность отсчета. При отсчете вода в круглой воронке и бюретке должна быть на одном уровне.

Определяют активность каталазы в листьях верхнего и нижнего ярусов. Можно использовать также проростки различных сортов сельскохозяйственных культур, различающихся по скороспелости к неблагоприятным воздействиям.

Результаты опыта заносят в таблицу:

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) растение с несколькими ярусами листьев, проростки пшеницы или другой культуры; 2) промытый речной песок; 3) порошок мела; 4) 3%-ный раствор перекиси водорода; 5) фарфоровые ступки с пестиком; 6) мерные цилиндры на 25 мл; 7) прибор для определения каталазы; 8) часы; 9) весы с разновесами.

Определение активности каталазы

(по А.Н. Баху и А.И. Опарину)

Оксидоредуктазы – класс ферментов катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Окисление мономеров, образующихся в процессе катаболизма полимеров, представляет собой сложный многоступенчатый процесс.

Окисление веществ в клетках протекает, в основном, путем отщепления водорода (дегидрированием) или отщеплением электронов или путем присоединения кислорода к молекуле окисляемого соединения.

Акцепторами водорода у дегидрогеназ является НАД + , НАДФ, ФАД и ФМН, у некоторых флавиновых – кислород (их называют оксидазами), у гемсодержащих (пероксидаз и каталазы) – Н 2 О 2 (пероксид водорода).

Акцепторами и переносчиками электронов являются цитохромы, содержащие гем (гемопротеины).

Каталаза (КФ 1.11.1.6) относится к гемопротеинам, катализирует процесс разрушения ядовитого для клеток пероксида водорода на воду и кислород: 2 H 2 O 2 = 2 H 2 O + O 2 .

Для живой клетки пероксид водорода является сильным ядом, поэтому все ферменты образующие и обезвреживающие Н 2 О 2 находятся в пероксисомах – органеллах покрытых мембраной. Главными потребителями Н 2 О 2 являются пероксидазы (КФ 1.11.1.7.), которые окисляют фенолы, амины, некоторые гетероциклические соединения и др. субстраты дегидрированием, переносят снятые с субстратов на Н 2 О 2 , восстанавливая его до 2 Н 2 О. Молекулы пероксида водорода, невостребованные пероксидазами, обезвреживаются каталазой.

Метод определения активности каталазы основан на определении количества пероксида водорода, расщепленного в процессе инкубации с ферментом. Количество H 2 O 2 в реакционной смеси определяют титрованием в кислой среде раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 +8H 2 O

На основании приведенного уравнения реакции можно рассчитать, что 1 мл раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л соответствует 1,7 мг (50 мкмоль) пероксида водорода.

ХОД РАБОТЫ. 2-3 г сырого картофеля (или другого свежего растительного материала) тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклом. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике скальпеля CaCO 3 до прекращения выделения пузырьков СО 2 . В процессе растирания в ступку добавляют небольшими порциями 40-50 мл воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Смесь оставляют стоять 10-15 мин и после перемешивания фильтруют.

Берут две конические колбочки вместимостью 150-200 мл и вносят в них по 20 мл полученного фильтрата. Содержимое одной колбы кипятят в течение 1 мин и охлаждают до комнатной температуры (контроль). Другая колба опытная содержит активный фермент. К содержимому опытной и контрольной колб приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора с массовой долей H 2 O 2 1 %. Содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По окончании инкубации в обе колбы добавляют по 5 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 %, перемешивают и избыток H 2 O 2 в каждой колбе оттитровывают раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л до образования розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.

Активность каталазы выражают в мкмоль пероксида водорода, расщепившегося под действием фермента в расчете на 1 г исследуемого материала (или на 1 мг вытяжки из него) за 1 мин. Вычисление ведут по формуле:

где Х – активность каталазы, Е/г;

(а-b) – разность между объемами раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л, пошедшего на титрование контрольной (а) и опытной (b) проб, мл;

Т – титр примененного для титрования раствора перманганата калия;

50 – коэффициент пересчета на мкмоль H 2 O 2 ;

100 – общий объем приготовленного экстракта;

m – масса взятого для анализа материала, г;

20 – объем фильтрата, взятого для анализа, мл;

30 – время инкубации, мин.

Принцип определения, порядок анализа и результат анализа записывают.

Активность каталазы можно определить и по объему кислорода, выделившегося после прибавления к исследуемому объекту H 2 O 2 .

Этот принцип используют для определения активности каталазы в молоке, выражаемую каталазным числом, представляющим собой объем кислорода (мл) выделившийся за 2 часа при 25 °С из добавленных к 15 мл молока 5 мг раствора с массовой долей H 2 O 2 1 %. Молоко, полученное от здоровых животных, выделяет 0,7-2,5 мл кислорода, т.е. каталазное число натурального молока составляет не более 2,5. Молоко, полученное от больных животных (мастит и др.), и молозиво имеют повышенные каталазные числа, достигающие до 15.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; кальций углекислый (порошок); раствор с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л; растворы с массовыми долями: пероксида водорода 1 % (10 мл раствора с массовой долей H 2 O 2 30 % разбавить водой до 300 мл), серной кислоты 10 %.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Основные пути окисления субстратов в клетке.

2. Характеристика строения и действия НАД + - и НАДФ-зависимых дегидрогеназ.

3. Характеристика строения и действия ФАД-зависимых дегидрогеназ.

4. Какие ферменты называют оксидазами? Их кофакторы.

5. Характеристика строения и действия пероксидаз и каталаз.

6. Характеристика строения и действия цитохромов.

7. Химизм, образование и пути обезвреживания пероксида водорода в клетках.

8. Метод определения активности каталазы.

Ферменты являются белковыми катализаторами биохимических реакций, большая часть которых в отсутствие фермента протекала бы крайне медленно. В отличие от химических катализаторов каждый фермент способен катализировать лишь очень небольшое число реакций, часто только одну.

Таким образом, ферменты это реакционно-специфические катализаторы. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами.

Многие ферменты оказывают каталитическое действие на субстраты только в присутствии специфического термостабильного низкомолекулярного органического соединения – кофермента.

В таких случаях холофермент (каталитически активный комплекс) состоит из апофермента (белковая часть) и связанного с ним кофермента (Приложение Н). Кофермент может быть связанным с апоферментом ковалентными и нековалентными связями. Термин «простетическая группа» относится к ковалентно связанному коферменту. К числу реакций, требующих присутствия кофермента, относятся: окислительно-восстановительные, переноса групп, изомеризации, а также реакции конденсации (по системе IUB это классы 1, 2, 5, 6). Реакции расщепления протекают в отсутствие коферментов (по системе IUB это классы 3 и 4).

^ 4.1 Лабораторная работа «Определение активности амилазы
солода по методу Вольгемута»

Метод Вольгемута основан на определении минимального количества фермента, способного при определенных условиях полностью гидролизовать 1 мл 0,1 %-ного раствора крахмала. Амилазная активность солода выражается количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может быть гидролизовано 1 мл вытяжки из солода при температуре 38 °С в течение 30 мин. В норме амилазная активность равна от 160 до 320 единиц активности.

Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности крови и мочи, в пивоварении – для определения амилазной активности солода. Резкое повышение амилазной активности в крови и моче (в 10–30 раз) наблюдается при острых панкреатитах, опухолях поджелудочной железы.

^ Материалы и реактивы: вытяжка из солода зерновых, разбавленная в 10 раз; 0,1 %-ный раствор крахмала; 0,1 %-ный раствор йода в 0,2 %-ном растворе иодида калия.

Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, капельницы, термостат.

^ Ход работы. В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в 10 раз вытяжки, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают и 1 мл переносят в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из последней пробирки отбирают 1 мл и выливают. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Разведение вытяжки в десяти пробирках составит: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл раствора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой для прекращения действия фермента, добавляют по две капли раствора йода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением окраски. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвет.

Отметив, при каком разведении произошел полный гидролиз крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с желтоватой окраской содержимого), по количеству неразведенной вытяжки (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность вытяжки
(А мл вытяжки расщепляет Х мл 0,1 %-ного раствора крахмала).

Например, желтый цвет появился в четвертой пробирке, где вытяжка разведена в 160 раз. Это количество вытяжки способно гидролизовать 2 мл 0,1 %-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной вытяжки в тех же условиях гидролизует 320 мл: Х = 2×160/1. Следовательно, амилазная активность равна 320.

^ 4.2 Лабораторная работа «Определение активности каталазы

по Баху»

Метод основан на определении количества пероксида водорода, оставшегося после действия на него каталазы, титрованием на него раствора KMnO 4 . Реакция протекает по уравнению

1 мл 0,1 моль/л раствора перманганата калия соответствует 85 мг пероксида водорода.

^ Материалы и реактивы: препарат каталазы (1 г проростков солода ячменного растирают в фарфоровой ступке с 6 мл фосфатного буфера и фильтруют); 10 %-ный раствор H 2 SO 4 ; 0,1 %-ный раствор пероксида водорода на фосфатном буфере, pH=7,0 (35,0 мл 0,2 моль/л NaH 2 PO 4 в 13,6 мл 0,2 моль/л NaH 2 PO 4); 0,1 моль/л раствор KMnO 4 .

Оборудование: колбы емкостью 100 мл, пипетки, бюретки, термостат.

^ Ход работы. В две колбы вносят по 2 мл препарата каталазы, в одну из них (проба) прибавляют 1 мл 10%-ного раствора H 2 SO 4 , затем наливают по 2 мл раствора пероксида водорода в каждую колбу, ставят в термостат на 40 мин при температуре 38 °С. По истечении времени инкубации во вторую колбу (контроль) прибавляют 1 мл 10 %-ного раствора H 2 SO 4 и оба раствора титруют 0,1 моль/л раствором KMnO 4 до появления стойкого розового окрашивания от излишка перманганата калия.

Активность каталазы определяют по количеству разложенного пероксида водорода (мл) и рассчитывают по формуле:

,

Где
– разность результатов титрования контрольного и исследуемого образцов 0,001 н раствором KMnO 4 , мл;

Q – количество пероксида водорода (85 мг), соответствующее
1 мл 0,1 моль/л раствора KMnO 4 .

^ 4.3 Лабораторная работа «Капельный метод
(по Климовскому и Родзевич)»

Амилолитическая активность, обусловленная в основном наличием в препарате α-амилазы, характеризует способность фермента катализировать гидролиз крахмала до неокрашиваемых йодом продуктов. При наличии в препарате α-амилазы и глюкоамилазы этим методом определяется суммарное действие всех амилолитических ферментов.

За единицу амилолитической активности в этом методе принято такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 г растворимого крахмала до продуктов, неокрашиваемых йодом, за 1 час при температуре 30 ºС в строго определенных условиях. Амилолитическую активность АС выражают числом указанных единиц в 1 г препарата, культуры или в 1 см 3 раствора. Величина АС показывает, сколько граммов крахмала может быть гидролизовано до неокрашиваемых йодом соединений 1 г препарата, культуры или 1 см 3 раствора за 1 ч в условиях определения. Окончание реакции контролируют визуально по йодной пробе.

Чувствительность метода определяют минимальным количеством времени, за которое можно визуально уловить изменение окраски йода. Допускают, что скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству применяемого фермента и остается постоянной на протяжении от 5 мин до 1 ч, то есть реакция подчиняется закону реакции нулевого порядка. Кроме того, установлено влияние величины рН и химической природы буфера на величину АС. С ацетатным буфером (рН=4,7) величина АС у грибных препаратов в среднем в 1,5 раза выше, чем при определении с фосфатным буфером (рН=6,0). Поэтому, при определении величины АС грибных культур рекомендуется брать ацетатный буфер.

Недостатком метода является нечеткость визуального определения окончания реакции.

^ Материалы и реактивы: ацетатный буфер с рН=4,7 для ферментов грибного происхождения; фосфатный буфер с рН=6,0 для ферментов бактериального происхождения; 1 %-ный раствор крахмала (раствор крахмала, употребляемый для анализа грибных препаратов, должен иметь рН=4,7, для анализа бактериальных препаратов – 6,0); растворы йода. Для приготовления основного раствора йода в тарированный стаканчик с притертой крышкой отвешивают 4,4 г йодида калия, 1,4 г металлического йода, добавляют около 2 см 3 дистиллированной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содержимое перемешивают и после растворения йода переводят раствор в мерную колбу объемом 100 см 3 с притертой пробкой. Доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы хранят в темном прохладном месте. Основным раствором йода можно пользоваться в течение 30 дней со дня его приготовления. Рабочий раствор йода готовят из основного раствора. Для этого 20 см 3 основного раствора йода наливают в мерную колбу вместимостью 100 см 3 , добавляют 4,4 г йодида калия и доводят общий объем раствора до 100 см 3 . Рабочий раствор йода может быть употреблен в течение шести дней после его приготовления.

Оборудование: широкие пробирки, стеклянные палочки, пипетки, стаканы объемом 50 мл, чашки Петри, термостат.

^ Ход работы. Для определения значения АС важно строго соблюдать условия реакции. Для этого предварительно все растворы – субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до температуры 30 °С.

Субстрат в количестве 25 см 3 (12,5 мл) помещают в широкую пробирку, в которую вставлена стеклянная палочка. 30 см 3 (15 мл) вытяжки и 30 см 3 (15 мл) воды наливают в отдельные пробирки, помещают в термостат и выдерживают при температуре 30 ºС в течение
10 минут.

Затем в широкую пробирку к раствору крахмала, не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток добавляют от 1 до 25 см 3 исходного ферментного раствора и соответствующее количество воды так, чтобы общий объем реакционной смеси был 50 см 3 . Если ферментная вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см 3 , а воду вообще не добавлять.

Содержимое пробирки перемешивают палочкой и отмечают время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала. Через каждые 60 секунд из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирают палочкой каплю пробы. Каплю помещают на белую фарфоровую пластину, соединяют эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдают окраску. Реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 секунд. Изменение окраски отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель – йода и реакционной смеси.

Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в пределах от 10 до
20 минут.

Если время гидролиза менее 10 мин, определение повторяют, беря на гидролиз меньше вытяжки и больше воды. Если гидролиз не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, беря на определение больше ферментной вытяжки и меньше воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза.

Если ферментная вытяжка имеет малую или слишком высокую активность, и количество ферментного раствора от 1 до 25 см 3 не обеспечивает длительности гидролиза крахмала в течение 10…20 мин, то для анализа берут не 25 см 3 раствора крахмала, а большее или меньшее его количество, например, 10 или 40 см 3 , внося соответствующую поправку в расчетную формулу (соответственно 0,1 или 0,4 вместо, обычных 0,25).

Величину значения амилолитической активности АС (ед./г) рассчитывают по формуле:

Где 0,25 – количество крахмала, которое находится в 25 см 3 1 %-ного раствора, г;

60 – коэффициент пересчета на 1 ч;

N – количество фермента, участвующего в реакции, г или см 3 (эта величина определяется с учетом концентрации исходной вытяжки и последующего разведения);

T – время, за которое произошло расщепление крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов, мин.

Пример. Для анализа взята ферментная вытяжка воздушной культуры гриба. Исходный раствор приготовлен из расчета 5 г культуры в 100 см 3 забуференной воды. Известно, что данная культура очень активна, поэтому сделано дополнительное разведение исходного раствора: 20 см 3 доведено в мерной колбе до 50 см 3 дистиллированной водой и оттуда на анализ взято 2 см 3 , т.е. получена такая последовательность разведения:

5 г → 100 см 3 → 20 см 3 → 50 см 3 → 2 см 3 .

Для гидролиза 0,25 крахмала (25 см 3 1 %-ного раствора крахмала) ферментным раствором последнего разведения (2 см 3) потребовалось 12 мин. Тогда АС воздушно-сухой культуры (ед./г) составит:

При пересчете ферментативной активности следует учитывать не абсолютно сухое вещество ферментного препарата, а с учетом влажности. Расчет следует производить по формуле:

,

Где W – влажность культуры или препарата.

^ 4.4 Лабораторная работа «Метод Вильштеттера
и Вальдшмидта-Лейтца определения протеолитической
активности ферментов в модификации»

Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражается количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 1 г препарата или 1 см 3 ферментного раствора за 1 ч при температуре 40 ºС.

За единицу протеолитической активности принимается количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 ч при принятых условиях опыта.

^ Материалы и реактивы: 96 %-ный этиловый спирт; 1 %-ный раствор тимолфталеина; 0,1 н раствор NaOH; субстрат – 5 %-ный раствор желатина; вытяжка из анализируемого растения.

Приготовление вытяжки для определения протеолитической активности: навеска 0,25 г растительного материала помещается в фарфоровую ступку и растирается в течение 2,5 мин с 2,5 мл фосфатного буфера (рН=7,3), далее масса фильтруется.

Приготовление 5 %-ного раствора желатина (субстрат): 5 г желатина предварительно замачивается в стеклянном стаканчике в 15…20 см 3 дистиллированной воды в течение 20…30 мин. Набухший белок заливается 20…25 см 3 буферного раствора с температурой от 70 до 80 °С и тщательно перемешивается стеклянной палочкой. Растворившаяся часть сливается в мерную колбу объемом 100 см 3 , к нерастворившейся части добавляется еще 20…25 см 3 буферного раствора, и полученный раствор снова переносится в эту же колбу. Охлажденный до 40 °С раствор желатина доводится до метки буферным раствором такой же температуры. Готовый раствор желатина хранится в холодильнике при температуре от 2 до 5 °С и используется для анализа в течение двух суток. Перед анализом раствор желатина нагревается до температуры 40 °С на водяной бане.

Оборудование: конические колбы объемом от 200 до 250 мл, мерные колбы объемом 50 мл, стеклянные палочки, пипетки, бюретки, термостат.

^ Ход работы. К 10 см 3 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 приливают 2 см 3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см 3 реакционной смеси в коническую колбу емкостью от 50 до 100 см 3 , куда предварительно наливают 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см 3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют 0,1 н раствором NaOH до появления голубой окраски.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40 ºС для гидролиза. Через 3 ч 1 см 3 реакционной смеси отбирают во вторую колбу емкостью от 50 до 100 см 3 , куда предварительно наливают 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см 3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют, как в случае контрольного варианта.

Расчет протеолитической активности ПС проводят по формуле:

,

Где А – количество аминного азота, накопленного за время опыта из реакционной среды, мл;

T – продолжительность протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см 3 жидкого ферментного раствора.

Величину А рассчитывают по формуле:

,

Где а – количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1 см 3 опытной пробы, см 3 ;

А к – то же для контрольной пробы;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.